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了解果蔬组织中淀粉酶的特点，学习淀粉酶活性的测定原理和方法。
二、基本原理
果蔬组织中的淀粉可在淀粉酶作用下转化形成还原糖。淀粉酶对淀粉的分解作用是生物体利用淀粉进行碳水化合物代谢的初级反应。
淀粉酶（Amylase）包括几种催化特点不同的成员，它们广泛存在于动物、植物和微生物界。几乎所有植物中都存在有淀粉酶，特别是萌发后的禾谷类种子淀粉酶活性z强。不同来源的淀粉酶，性质有所不同。重要的淀粉酶主要包括α-淀粉酶、β-淀粉酶和葡萄糖淀粉酶等。其中，α-淀粉酶随机地作用于淀粉的非还原端，即作用于直链淀粉和支链淀粉的直链部分α-1,4-糖苷键，生成麦芽糖、麦芽三糖、寡聚葡萄糖、α-j限糊精等还原糖，同时使淀粉浆的粘度下降，因此又称为液化酶。α-淀粉酶比较耐热但不耐酸，在pH3.6以下迅速钝化。Ca2+却能使α-淀粉酶活化和稳定。β-淀粉酶从淀粉的非还原端作用于α-1,4-糖苷键，每次切下一分子麦芽糖，遇到支链淀粉的α-1,6-糖苷键时停止，生成β-j限糊精。β-淀粉酶又被称为糖化酶，它是一种巯基酶，不需要Ca2+及Cl-等辅助因子。与α-淀粉酶相反，β-淀粉酶不耐热但却耐酸，在70 ℃保温15 min可使其钝化。根据它们的这种特性，钝化其中之一，就可测出另一个的活性。葡萄糖淀粉酶则从淀粉的非还原端每次切下一个葡萄糖。
淀粉酶催化产生的还原糖能使3,5-二硝基水杨酸还原，生成棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。淀粉酶活性的大小与生成的还原糖的量成正比。因此，可以用麦芽糖制作标准曲线，用比色法测定淀粉水解生成的还原糖的量，以单位重量样品在一定时间内生成的还原糖的量表示酶活性。通常提取液中α-淀粉酶和β-淀粉酶同时存在。本实验中先测定（α+β）淀粉酶总活性，然后在70 ℃加热15 min，钝化β-淀粉酶，测出α-淀粉酶活性。再与总活性（α+β）相比较，求出β-淀粉酶的活性。
三、材料、仪器及试剂
（一）材料
马铃薯、香蕉、芒果等。
（二）仪器及用具
电子天平、分光光度计、离心机、恒温水浴锅（40 ℃、70 ℃、100 ℃）、具塞刻度试管（20 mL）、移液器或刻度吸管、容量瓶、研钵、离心管、试管。
（三）试剂
1．标准麦芽糖溶液（1 mg/mL）
j确称取100 mg麦芽糖，用蒸馏水溶解并定容至100 mL。
2．3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂
（1）配制500 mL含有185 g酒石酸钾钠的热水溶液；
（2）配制262 mL 的2 mol/L NaOH溶液；
（3）称取6.3 g的3,5-二硝基水杨酸；
（4）称取5.0 g结晶酚；
（5）称取5.0 g亚硫酸钠；
（6）将（2）、（3）、（4）、（5）各成分加入到（1）中，搅拌，使之溶解。待冷却后，转入到1 000 mL容量瓶中，并用蒸馏水定容至刻度，贮于棕色瓶中备用。盖紧瓶塞，勿使CO2 进入。若溶液混浊可过滤后使用。
3．100 mmol/L、pH 5.6的柠檬酸缓冲液
母液A（200 mmol/L柠檬酸）：称取42.03 g C6H8O7·H2O2，用蒸馏水溶解、定容至1 000 mL。
母液B（200 mmol/L柠檬酸钠）：称取58.82 g Na3C6H5O7·2H2O2，用蒸馏水溶解、定容至1 000 mL。
取27.5mL 母液A与72.5 mL 母液B，混匀，调节pH至5.6，用蒸馏水稀释至200 mL，即为100 mmol/L、pH 5.6的柠檬酸缓冲液。
4．1%淀粉溶液
称取1 g可溶性淀粉溶于100 mL 100 mmol/L、pH5.6的柠檬酸缓冲液中。
（一）麦芽糖标准曲线的制作
取7支具塞刻度试管，编号，按表13加入试剂。摇匀，置沸水浴中煮沸5 min。取出后流水冷却，加蒸馏水至20 mL。以0号管作为空白调零，在波长540 nm处比色测定。以麦芽糖含量为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线，求得线性回归方程。
表13.淀粉酶活性测定绘制麦芽糖标准曲线的各试剂加入量
（二）酶液制备
称取10.0 g果蔬组织样品，置于研钵中，加10 mL蒸馏水，研磨成匀浆后转入离心管中，混合，在室温（20 ℃）下放置提取20 min，每隔数分钟摇动一次。然后于8 000 rpm离心20 min，收集上清液，转入50 mL容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，摇匀，即为淀粉酶提取液，用于α-淀粉酶活性和淀粉酶总活性的测定。
（三）活性测定
取6支具塞刻度试管，编号，按表14进行操作。
表14.淀粉酶活性测定过程
加入DNS试剂后，摇匀各试管，置沸水浴中煮沸5 min，取出后迅速冷却，加蒸馏水至20 mL，摇匀。按照与制作标准曲线相同的方法，在540 nm波长下比色，记录测定结果。
五、实验结果与计算
1．将测定的数据填入下表
2．计算结果
用I-2、I-3吸光度平均值与I-1吸光度值之差，II-2、II-3吸光度平均值与II-1吸光度值之差，分别在标准曲线上查出相应的麦芽糖量（mg），计算α-淀粉酶的活性和淀粉酶总活性，然后再计算出β-淀粉酶活性。淀粉酶活性以每分钟每克鲜重果蔬样品中酶催化作用下产生麦芽糖毫克数表示，即mg·min-1·g-1 FW。
β-淀粉酶活性 (mg·min-1·g-1 FW) = 淀粉酶总活性－α-淀粉酶活性
式中：
Cα——查标准曲线求得α-淀粉酶水解淀粉生成的麦芽糖量，mg；
CT——查标准曲线求得（α+β）淀粉酶共同水解淀粉生成的麦芽糖量，mg；
V——淀粉酶提取液体积(α-淀粉酶为50 mL)，mL；
VⅠ——测定α-淀粉酶时吸取酶提取液的体积，mL；
VⅡ——测定总（α+β）淀粉酶时吸取酶提取液的体积，mL；
t ——酶作用反应时间，min；
W ——样品重量，g。
六、注意事项
1．测定淀粉酶总活性时有时需要稀释。样品提取液的定容体积和酶液稀释倍数可根据不同材料酶活性的大小而定。
2．DNS试剂是强碱性试剂，在淀粉原酶液和稀释液中分别先加入DNS试剂（I-1、II-1号试管），可以钝化酶活性，作为空白对照。
3．为了确保酶促反应时间的准确性，在进行保温这一步骤时，可以将各试管每隔一定时间依次放入恒温水浴，准确记录时间，到达5min 时取出试管，立即加入3,5-二硝基水杨酸以终止酶反应，以便尽量减小因各试管保温时间不同而引起的误差。
4．同时恒温水浴温度变化应不超过±0.5℃。酶反应需要适当的温度，只有在一定的温度条件下才表现出z大活性，40℃是淀粉酶的z适温度，所以应将酶液和底物（淀粉液）先分别保温至z适温度，然后进行酶反应，这样才能使测得的数据更加准确。
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